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Die HPLC ist eine physikalische Methode um Stoffe, durch eine Verteilung zwischen der mobilen, sich bewegenden und der stationären, ruhenden Phase, zu trennen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Die HPLC, high performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie), ist ein Trennverfahren, bei dem die Probenflüssigkeit durch eine Trennsäule, aufgrund eines hohen Druckes, anhand der flüssigen Phase, über die stationäre Phase transportiert wird. Die Länge und der Durchmesser der Trennsäule variieren je nach Anwendungsgebiet. In manchen Fällen wird dieser Säule noch eine Vorsäule vorangestellt, um Verunreinigung vor der Trennung zu entfernen. Im Gegensatz zur Gaschromatographie sind in der HPLC keine gasförmigen oder unzersetzt verdampfbare Substanzen notwendig. Bei starken Wechselwirkungen der zu untersuchenden Substanz mit der stationären Phase, verbleibt diese relativ lange in der Säule. Bei schwachen Wechselwirkungen tritt genau der umgekehrte Fall ein. Die zu untersuchende Substanz verlässt die Säule relativ früh. Folglich erscheinen die Substanzen am Ende der Trennsäule nach unterschiedlichen Zeiten, den sogenannten charakteristischen Retentionszeiten. Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie kann zwischen zwei Prinzipien differenziert werden. Die Normalphasen- und die Umkehrphasenchromatographie. Handelt es sich um die NP-HPLC so wird eine polare stationäre Phase, wie z. B. Kieselgel, eingesetzt. Die Polarität bestimmt bei diesem Vorgang die Stärke der Elutionskraft der mobilen Phase. Die Anordnung der Lösungsmittel erfolgt nach ansteigender Polarität, der sogenannten elutropen Reihe. Dies bedeutet, mit steigender Polarität wird die Substanz umso schneller eluiert. Polare Moleküle wechselwirken mit der polaren stationären Phase stärker und verbleiben somit länger in der Säule. Bei einer RP-HPLC wird eine stationäre unpolare Phase verwendet. Die Elutionskraft sinkt mit steigender Polarität.
In der HPLC lässt sich, abhängig von der Wechselwirkungsart zwischen stationärer Phase, mobiler Phase und der Probe, zwischen mehreren Trennmechanismen differenzieren: nämlich die Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Ausschluss- und Affinitätschromatographie. Jedoch wird bei der HPLC meist die Adsorptions- und die Verteilungschromatographie angewendet.
Ein HPLC-System besteht aus einem Eluentengefäß, einem Entgaser, einer Pumpe, einem Injektionsventil, einer Vorsäule, einer Säule, einem Detektor und einer Auswerteeinheit.
Die Funktionsweise von HPLC-Pumpen beruht auf der konstanten Beförderung des Eluenten gegen einen hohen Druck. Wichtige Eigenschaften von HPLC-Pumpen, um qualitative und quantitative Aussagen aus den Detektorsignal treffen zu können, stellen die pulsations- und totvolumenarme Arbeitsweise, die hohe Langzeitkonstanz und die Zuverlässigkeit dar. Heute kommen meist Pumpen, die einen konstanten Fluss, auch bei Veränderung des Gegendruckes des Systems gewährleisten, zum Einsatz. Im Allgemeinen hängt der Druck durch die Säule von der Teilchengröße der stationären Phase, der Säulenlänge und den zusätzlich vorhandenen Probenbestandteilen ab. Zusätzlich beeinflusst die Viskosität des Eluenten den Gegendruck.
Bei HPLC-Pumpen auf Gradientenbasis wird über die Flussregelung der Pumpe eine konstante Fließgeschwindigkeit garantiert. Der Eluent wird somit während des Trennvorgangs variabel zusammengesetzt und die Fließmittelstärke erhöht. Zu unterscheiden sind hierbei diskontinuierliche und kontinuierliche Pumpen. Bei diskontinuierlichen Pumpen wird das Reservoir pulsationsfrei geleert. Jedoch werden diese kaum noch verwendet und sind für das Gradienten-Prinzip nicht geeignet. Bei kontinuierlichen Pumpen wechselt sich das Ansaugen und Fördern des Lösungsmittels fortdauernd ab. Somit wird ein ständiger Fluss des Eluenten garantiert.Literatur•http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Hochleistungsfl%C3%BCssigkeitschromatographie&oldid=86523806 (Abgerufen: 30.03.11).•http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/3/anc/croma/hplc_detail1.vlu/Page/vsc/de/ch/3/anc/croma/hplc/pumpen/pumpm63ht0900.vscml.html (Abgerufen: 30.03.11).
