Firma:                   Weber

Modell:                Oktopus

Kommentar:        Dokumente deut.

I.E.F. AUF OCTOPUS C.H.I.E.F.

Verfahren und Apparatur zur Free-Flow-Elektrophorese:

Der Begriff Free-Flow-Elektrophorese wird fast ausschließlich für ein Verfahren mit folgenden wesentlichen Merkmalen benutzt:

-            Das elektrophoretische Verfahren wird in einem "freien" Elektrolyten durchge‑
führt, d.h. es fehlt jegliches Trägermaterial wie Agarose, Polyacrylamid etc.

-            Dieses Verfahren wird fast ausschließlich als kontinuierliches, in wenigen Fällen als Recycling-Verfahren in der Literatur beschrieben.

Kurzbeschreibung der kontinuierlichen Free-Flow-isoelektrischen Fokussierung

Zwischen zwei planparallelen Platten, mit einem Abstand von 0.3 -1 mm, strömt ein laminarer Film eines oder mehrerer Elektrolyten, nachfolgend Medien oder im spe­ziellen Trennmedien genannt.

Parallel zur laminaren Strömung der Trennmedien sind in inem Abstand von 100 mm Elektroden angeordnet. Wird nun an diese Elektroden eine Hochspannung ange­legt so verlaufen die Kraftlinien des daraus resultierenden elektrischen Feldes sen­krecht zur linearen Geschwindigkeit der Medien.

Wird nun ein Substanzgemisch mit unterschiedlichen elektrophoretischen Eigen­schaften in den Bereich kurz vor Beginn des elektrischen Feldes in die Trennkammer eingebracht, so werden die Einzelkomponenten einerseits mit dem Strom der Me­dien transportiert, wandern gleichzeitig aber auch unter dem Einfluß des elektri­schen Feldes.

Daraus resultieren je nach Free-Flow-Trennverfahren Wanderungsstrecken der Ein­zelkomponenten, die deutlich aus der vertikalen Transportrichtung abweichen. )e nach Free-Flow (FF)-Verfahren sind diese Wanderungsstrecken gerade (FF-Zonelek­trophorese) oder gekrümmt (FF-isoelektrische Fokussierung).

Die auf verschiedenen Bahnen wandernden Einzelsubstanzen erreichen das Ende des Trennraumes an verschieden Orten und werden dort durch eine Multikanalfraktio­niervorrichtung gleichzeitig zu separaten Auffanggefäßen transportiert.

In der Regel wird in das kontinuierlich strömende Trennmedium solange Probe kon­tinuierlich zugegeben, bis der gesamte dafür vorgesehene Probenvorrat zudosiert ist (präparative Arbeitsweise).

Die Probe kann aber auch intermittierend in geringen Volumina bis herab zu 30 µl zudosiert und nachfolgend in geeigneten Sammelgefäßen fraktioniert werden (mi‑

kropräparative Arbeitsweise).

lDie bei diesen Elektrophoreseverfahren entstehende Wärme wird über einen extern angeschlossenen -Kältethermostaten abgeführt.

Nachfolgend die wichtigsten technischen Spezifkationen des Gerätes OCTOPUS C.H.I.E.F. in der Standardversion:

Trennkammer.                            Außendimensionen:                             640 X 180 X 80 mm

                                               Trennraumdimensionen:                       500 X 100 X 0,5 mm

                                               Gewicht                                              ca. 55 kg

Fraktionierung:                           96 Fraktionen, Abstand 1,1 mm

Sammelgefäße:                         alternativ in.

                                               M krotiterplatten oder

                                               Micronic 1,5 ml Röhrchen

Medienpumpe:                           8 Kassetten

                                               1 Schlauch für Trennmedium

                                                         2 Schläuche für Stabilisierungsmedia

1 oder 2 Schläuche für Gegenstrom

1 Schlauch für Probe

Isoelektrische Fokussierung in natürlichen Gradienten

Bei diesem Trennverfahren strömt über mehrere Einlässe ein Puffergemisch mit am­photeren Substanzen oder eine Ampholytlösung in die Trennkammer. Unter dem Einfluß des elektrischen Feldes bildet sich während des Durchlaufes ein pH-Gradient aus. In diesem pH-Gradienten kann die zu trennende Probe entweder über eine oder mehrere Zuführungsstellen der Medien oder auch über eine separate Dosierstelle zu­gegeben werden. Die Komponenten der Probe werden nachfolgend gemäß ihren un­terschiedlichen Werten des isoelektrischen Punktes getrennt und fokussiert. Das o.g. Verfahren erfordert relativ lange Verweilzeiten im Bereich von 10-30 Minuten.

Trennung in künstlichen pH-Gradienten bzw. pH-Stufen

In diesem Verfahren wird jeder einzelne Medieneinlaß mit einem unterschiedlichen Gemisch von Säuren und Basen bzw. amphoteren Substanzen beschickt, so daß beim Durchlauf durch die Trennkammer (ohne Hochspannung) ein mehrstufiges pH-Profil entsteht. Unter dem Einfluß des elektrischen Stromes werden nachfolgend diese scharfen pH-Sprünge abgeflacht. Die Wahl der Substanzen für die einzelnen Medien erfolgt je nach Trennproblem und dem bekannten pl- Wert der zu trennenden bzw. zu reinigenden Substanz.

Trennung im linearen pH Gradienten mit Hilfe von Servalyten® :

Das zugrunde liegende Verfahren wird in der Skizze B.2.3 dargestellt.

In diesem Verfahren werden gleichzeitig 3 Medien über 3 separate Einlässe zugeführt. Die Zusammensetzung dieser Medien ist wie folgt:

-            Trennmedium: 0.5 % Servalyt® + Additive

-            anodales Stabilisierungsmedium: 100 mM Phoshorsäure

-            kathodales Stabilisierungsmedium: 50 mM Natronlauge

Unter dem Einfluß der elektrischen Feldes bildet sich beim Durchlauf des Servalyten durch die Trennkammer ein linearer pH-Gradient bereits im unterem Teil der Trenn­kammer aus.

Die Probe, die gleichzeitig über eine separate Dosierstelle aufgegeben wird, wird

nachfolgend gemäß den unterschiedlichen pl-Werten der Einzelsubstanzen in dem pH-Gradienten aufgetrennt.

Je nach Problemstellung werden, bzw. müssen Additive verwendet werden wie:

-            Hydroxypropyl-methyl-cellulose (HPMC) oder ähnliche Polymere

-            Glycerin und oder Saccharose

-            nicht ionische Detergentien

-            Harnstoff

Je nach Anzahl und Art des Additives variieren die Prozeßparameter, wie die Hoch­spannung und die Verweilzeit, eventuell auch die Anzahl der Medien.

Die wichtigste Vorbedingung für gute Trennergebnisse der Apparatur sind möglichst ähnliche oder identische Werte der Dichte und Viskosität.

Aufbau der Trennkammer

Die eigentliche Trennkammer besteht im wesentlichen aus drei demontierbaren Teilen:

-            Trennkammer-Rückteil

-            Trennkammer-Vorderteil und

-            VA-Metallrahmen zur mechanischen Stabilisierung der gesamten Trennkammer, d.h. der Trennkammervorderteils und des Trennkammerrückteils.

Das Rückteil des VA-Rahmens ist mittels 2 Schrauben mit dem Gehäusegestell ver­bunden.

Das Trennkammerrückteil ist im wesentlichen ein kompakter Wärmetauscher aus Aluminium mit einer Oberfläche, die plan und poliert ist. Auf die Oberfläche ist eine dünne Glasplatte mit einer Dicke von 0.6-0.8 mm aufgeklebt. Die Glasplatte ermög­licht eine perfekte elektrische Isolierung des Wärmetauschers gegen die Hochspan­nung im Trennraum bei gleichzeitig gutem Wärmetransfer. Der Wärmetauscher ist an einen externen KühlkreisKältethermostaten angeschlossen.

Das Trennkammervorderteil besteht aus einem verwindungsteifen Block aus Plexiglas, der mit Schnappverschlüssen mit dem Trennkammerrückteil verbunden ist.

1n diesem Plexiglasblock sind entlang der Längsseite die Elektrodenkanäle ange­ordnet. Am Boden dieser Kanäle sind die Elektroden aus Platin untergebracht und darüber liegend die Elektrodendichtungen und die "Elektrodenmembranen". Die Elektrodenmembranen müssen den Elektrodenraum von dem Trennraum so abdich­ten, daß nur ein einseitiger ektrophoretischer Transport über die Grenzfläche der Membrane stattfindet.

Am unteren Ende des Trennkammer-Vorderteils befinden sich die Einlässe für

-            die Trennmedien

-            die Probe

-            die Anschlüsse für die Hochspannung

-            die Zuführungen für die Medien der Elektrodenpuffer

Am oberen Ende der Trennkammer sind 96 Auslässe, direkt nebeneinanderliegend angeordnet. diese Auslässe sind über 96 Teflonschläuche mit dem Fraktionssamm­lergehäuse verbunden.

Besondere Merkmale bzw. Vorteile des Verfahrens der kontinuierlichen isoelektrischen Fokussierung:

Zur Trennung einer Probe mit Bestandteilen, die unter den Bedingungen der Tren­nung Ladungen tragen und amphoter sind, erweist sich die Methode der kontinuier­lichen isoelektrischen Fokussierung als besonders "substanzschonend". Hohe Wieder­findungsraten werden erreicht, selbst bei labilen Biopolymeren.

Die wesentlichen Vorteile des Free-Flow-Trennprinzips sind:

-            Die Trennung erfolgt in einer strömenden Flüssigkeit, d.h. in Abwesenheit jegli­chen stationären Trägermaterials

-            Die Apparatur besitzt eine geringe Innenoberfläche, die von Natur aus weitge­hend inert ist und durch entsprechende "Coating-Verfahren" zusätzlich inaktiviert werden kann.

-            Die Verweilzeit der Probe im Trennraum ist zudem sehr kurz (5-20 Minuten). Dies macht die Methode anderen deutlich überlegen und leistet eine hervorragende Durchsatzkapazität bei präparativen Trennungen.

Im Vergleich zu anderen bzw. ähnlichen, präparativen Trennverfahren besitzt die Free-Now-Technik weitere Vorteile:

-            Der präparative Arbeitsbereich ist sehr breit. In der Praxis lassen sich je nach Dauer der Probenaufgabe und des Probenvolumens Substanzmengen im Bereich von Mikrogramm bis hin zu Gramm-Mengen trennen.

-            Die mit dem Gerät OCTOPUS erzielbare Trennleistung ist im Hinblick auf die Auflösung vergleichbar mit analogen analytischen Elektrophoreseverfahren auf Gelen (z.B. Trenntechnik auf Gelen, wie z.B. PAGIEF.)

Die Methode der Free-Flow-isoelektrischen Fokussierung stellt deshalb eine wichtige Ergänzung zu anderen Trennverfahren (z.B. Chromatographie, Extraktion, Ultrazen­trifugation etc.) dar.

Kurzbeschreibung des Gerätes:

OCTOPUS C.H.I.E.F. ist in zwei Versionen erhältlich:

•            die modulare Version, in der der Kältethermostat und das Hochspannungsnetzteil als externe (unabhängige) Einheiten angeschlossen werden können.

•            die Komplettversion, in der der Kältethermostat und Hochspannungsnetzteil in­tegriert sind.

Auf dem Gerät werden das Fraktionssammlergehäuse und die Vorratsflaschen für die Medien und alle Hilfslösungen plaziert.

In der linken Hälfte des Gerätes ist der Trennmodul untergebracht. Direkt unter dem Trennmodul befinden sich die Vorratsflaschen für die Elektrodenpuffer, und zwar:

-            links der anodische Elektrolyt

-            rechts der katholische Elektrolyt

Das Trennmodul wie auch die Elektrodenpuffer sind mit einer transparenten Tür ausgestattet, welche das Bedienungspersonal vor unsachgemäßer Berührung von Hochspannungsteilen schützt.

Bitte beachten!Das Hochspannungsnetzteil darf nicht über eine geräteexterne 220 V Steckdose versorgt werden, sondern muß unbedingt über die entsprechende Steck­verbindung auf der Rückseite des Elektronikeinschubes angeschlossen werden, damit es in die Sicherheitsabschaltung integriert ist. Der geräteinterne Anschluß des Kälte­thermostaten ist ebenfalls empfehlenswert, aber nicht zwingend. Bitte beachten Sie, daß die geräteinternen 220 V- Anschlüsse nur für einen maximalen Stromfluß von 10 Ampere ausgelegt sind!

In der rechten Seite des Gerätes sind 3 Schwenktüren ohne Sicherheitsschalter un­tergebracht. In dem oberen der 3 Schwenkteile befindet sich das elektrische Netz­schaltfeld mit allen manuellen Bedienungselementen.

Im mittleren Schwenkteil ist im Falle der Komplettversion das Hochspannungsnetzteil eingebaut. Im Falle der modularen Version ist diese Schwenktür nicht belegt.

Hinter der unteren Schwenktür sind die Medienpumpe und die Probendosierpumpe erreichbar.

Der Kältethermostat ist im Falle der Komplettversion direkt hinter dem Trennmodul platziert.

BESCHREIBUNG DES GERÄTES UND DER BAUTEILE

Beschreibung der Einzelbauteile

Die Trennkammer des OCTOPUS C.H.I.E.F. ist fest auf einem Rahmengestell mon­tiert. Eine Tür, versehen mit einer Sicherheitsabschaltung, montiert an der Vordersei­te des Rahmengesteils, ermöglicht den Zugriff zur Trennkammer. Dies bedeutet, daß ein Zugang zur Trennkammer nur möglich ist, wenn die Hochspannungsversorgung abgeschaltet ist. Dies dient insbesondere dem Schutz des Operators.

Die Trennkammer selbst besteht im wesentlichen aus 3 Teilen:

-            Halterahmen für Trennkammervorderteil und -rückteil, gefertigt aus Vierkantprofil aus VA-Stahl. In den Halterahmen integriert ist die Auflage- und Drehvorrichtung für das Trennkammer-Vorderteil.

-            Trennkammerrückteil, bestehend aus einem Aluminium-Hohlkörperprofil. Durch die Kanäle des Hohlkörpers strömt das Medium des externen Kühlkreislaufs. Eine Oberfläche (640 x 180 mm) ist plan gefräst und poliert. Auf die plane Fläche ist eine dünne Glasplatte mit einer Dicke von 0,6 - 0,8 mm aufgeklebt.

Auf Kundenwunsch kann diese Glasplatte durch eine Kombination von diversen elektrischen Isolationsmaterialien ersetzt werden.

Trennkammervorderteil

Dieses besteht aus einem Plexiglasblock mit den Abmessungen 650 x 180 x 30 mm. 1n dem Plexiglasblock sind auf der Vorderseite neben den Zuführungsstellen für die Medien (3 in der Standardversion), der Dosierstelle für die Probe, den Zu- bzw. Rücklaufleitungen für die Elektrodenpuffer und den Steckverbindungen für die Hochspannung sowie die Auslässe für die 96 Fraktionierschläuche untergebracht.

Die Fraktionierschläuche sind in einer Reihe eng nebeneinanderliegend angeordnet und sind mit dem umgebenden Plexiglasmaterial fest verklebt. Auf der Innenfläche des Plexiglasblockes, d.h. auf der vorderen Begrenzung des Trennraumes, befinden sich zwei kanalartige Vertiefungen mit einem Abstand von 100 mm. In diese Vertie­fungen sind die Platinenelektroden fest eingeklebt.

Bei Inbetriebnahme der Trennkammer werden nacheinander die Elektrodendichtun­gen, die Membranen und die Druckbeilagen in diese Kanäle eingelegt.

Fraktionierung:

Die aus dem Trennkammervorderteil austretenden 96 Fraktionierschläuche werden zu einer Verteilerplatte geführt, die auf das Fraktionssammlergehäuse aufgelegt wird.

Das Fraktionssammlergehäuse selbst ist auf der Deckplatte des Grätegestells plaziert. I

Fraktionssammlerdeckel

Das Material des Fraktionssammlerdeckels ist Plexiglas. 96 Durchführungen sind geometrisch so angeordnet, daß einerseits im mikropräparativen Maßstab in einer Mikrotiterplatte und andererseits präparativ in 96 Auffangröhrchen mit einem Innen­volumen von 1.5 bzw. 2.5 ml gesammelt werden kann.

In den Boden des Fraktionsammlers eingebaut ist der gemeinsame Ablauf für alle nicht gesammelten Fraktionen.

Hinter dem Fraktionssammlergehäuse befindet sich ein T-Hahn, über den der Fluß des Gegenstromes entweder zur Trennkammer oder über den Fraktionssammler zum gemeinsamen Ablauf geführt wird.

Auf speziellen Wunsch des Kunden kann das Fraktionssammlergehäuse mit einem Wärmetauscher zur Kühlung der gesammelten Fraktionen ausgerüstet werden. Dieser Wärmetauscher wird an den Kühlkreislauf des Kälteaggregates direkt nach der Trennkammer angeschlossen.

Spezielle Versionen für steriles Arbeiten sind gemäß den Spezifikationen des Kunden möglich.

Dosierpumpen:

In der Standardversion des Gerätes wird die Probe über eine separate Kassette der Medienpumpe zugegeben. In der Regel wird unter den Bedingungen der Konditio­nierung des Prozesses über den Probekanal aus einem separaten kleinen Vorratsgefäß das Trennmedium zugegeben. Soll nachfolgend die Probe aufgegeben werden, wird der Excenter in der Probenkassette entspannt, der Zuführungsschlauch in das Pro­benvorratsgefäß getaucht und der Excenter wieder gespannt.

Eine Variation der dosierten Probemenge bei gleichbleibender Geschwindigkeit der Trennmedien ist in diesem Verfahren nur erreichbar, wenn die Startkonzentration der Probe und/oder der innere Durchmesserdes Förderschlauches in der Probenkassette geändert wird.

Die Probe kann auch über eine unabhängige Minischlauchpumpe zugegeben werden, die mit dem speziell dafür vorgesehenen 220V-Anschluß auf der Rückseite der Elek­tronikeinheit verbunden wird.

Eine für diese Anwendung ideale Pumpe liefert der Hersteller gerne auf Anfrage.

Kühlkreislauf:

Die während des Prozesses in der Trennkammer erzeugte Wärme wird durch den Kühlkreislauf des Kälteaggregates abgeführt. Als Kühlkreislaufinedium dient dabei eine Mischung aus 30 % Ethylenglykol, 30 - 50 % Wasser und 20 - 40 % Ethanol. Dieses Gemisch wird in den Behälter des Kühlgerätes eingefüllt. Die beiliegende Skiz­ze zeigt ein Blockschema für den Kühlkreislauf.

Bei den vom Hersteller empfohlenen Geräten ist sicher gestellt, daß diese Geräte in allen Spezifikationen den Anforderungen des C.H.I.E.F.-Prozesses genügen.

Bei der Verwendung von laboreigenen Geräten oder von Geräten dritter Hersteller muß geprüft werden, ob die nachfolgend genannten Spezifikationen erfüllt werden:

Kühlleistung:                    mindestens 80 W/0° C, besser C 100 W/0° C

ext. Kreislaufpumpe:         min. 5l/Std. bei 1 m Wassersäule

                                      max. Druck 5 m Wassersäule

Bitte beachten Sie! Die o.g. Spezifikationen genügen nur zur Durchführung des C.H.I.E.F.-Prozesses oder ähnlicher Prozesse mit einer maximalen elektrophoretischen Leistungsaufnahme von 30 Watt.

Die überschüssige Kälteleistung wird benötigt zum Ausgleich des Leistungsverlustes in den Zuleitungen und für eine Abkühlung des Trennkammerrückteils auf die Arbeits­temperatur in einer akzeptablen Zeit.

Elektrodenpufferkreislauf

Die Standardversion des OCTOPUS C. H.l. E. F. ist mit zwei unabhängigen Elektro­denpufferkreisläufen (d.h. mit zwei Reservoirs und zwei Membranpumpen) ausge­stattet.

Die Elektrodenpuffer-Vorratsflaschen sind nur über die Sicherheitsfronttür des Gerätes zugänglich.

Diese Sicherheitsvorrichtung soll verhindern, daß der Operator bei eingeschalteter Hochspannung beim Hantieren mit den Elektrodenpuffern mit spannungsführenden Teilen in Berührung kommt.

Für Langzeitexperimente (< 12 h) sollten Elektrodenpuffer-Vorratsgefäße mit größerem Volumen verwendet werden (bis 2l).

Elektrische Versorgungseinheit:

Alle elektrischen und elektronischen Baugruppen sind in der rechten Hälfte des Ge­rätes angeordnet.